多肽合成常見問題
1、肽合成的基本原理？
固相肽合成是肽合成化學的重要突破。其主要特點是無需純化中間產物，合成過程可以連續進行，為多肽合成的自動化奠定了基礎。目前多肽的全自動合成基本上是固相合成?；玖鞒倘缦?，
基于Fmoc化學合成，將目標肽C端氨基酸的羧基與不溶性聚合物樹脂共價連接，然后以該氨基酸的氨基為起始點合成肽，形成肽與其他氨基酸的活化羧基結合。重復此過程即可獲得肽。根據肽的氨基酸組成不同，肽的后處理方法不同，純化方法也不同。
2、生產肽的常用方法有哪些？
線性肽的肽鏈采用Fmoc固相合成法延長，氨基酸從C端到N端逐步連接。開始時，第一個氨基酸通過酸敏感接頭連接到不溶性支持樹脂上。用六氫吡啶除去 Fmoc 保護基后，連接第二個 Fmoc 保護的氨基酸。連接方式包括預激活或“一鍋”等。連接目標序列后，用TFA將肽鏈從樹脂上洗脫下來，得到粗品。
3、不同實驗如何選擇肽的純度？
肽的純度是一個很重要的指標，純度的選擇取決于實驗的目的。對于敏感性較低的篩選試驗，建議使用粗品或> 75%，對于免疫水平，建議使用> 85%。對于受體-配體相互作用研究、生物測定或細胞水平研究，推薦值 >95%，對于結構研究，推薦值 >98%。
4、什么是肽的凈含量（肽含量），它的意義是什么？
干肽的重量不僅含有肽，還含有一些非肽成分，如水、吸收的溶劑、配位離子和鹽。肽的凈含量是指其中肽的重量百分比。該百分比的值可以在 50% 到 90% 的范圍內，具體取決于純度、序列以及合成和純化。不要將肽的凈含量與肽的純度混淆。它們是兩個完全不同的概念。純度通常由 HPLC 測定。純度定義為肽樣品中序列正確的組分的百分比，而肽的凈含量是指樣品中肽物質相對于非肽物質的百分比。肽的凈含量通常通過氨基酸組成分析或紫外分光光度法測定。在某些對肽濃度敏感的實驗中，該信息對于計算肽濃度非常重要。
5、如果肽純度為 95%，剩下的 5% 是多少？
肽的純度通常由 HPLC 測定，標準乙腈梯度為每分鐘 1%。在合成過程中，氨基酸之間的交聯效率并不總是達到100%，從而產生了一系列氨基酸缺失雜質。這些氨基酸缺陷雜質大部分在純化過程中被去除，但其色譜性能與目標肽非常相似。這些氨基酸缺失在剩余的百分之幾中保留在肽樣品中。
6、非 HPLC 純化肽中存在哪些雜質？
粗品級和脫鹽級中的肽和非肽雜質：如非全長肽和一些肽后處理原料如DTT、TFA等。
7、多長的肽段合適？
肽合成需要考慮肽的長度、電荷和疏水性等因素。長度越長，粗品的純度和收率越低，提純難度越大，合成失敗的概率越大。當然，多肽功能區的序列是不能改變的，但為了多肽的順利合成，有時需要在功能區的上下游添加一些輔助氨基酸，以提高多肽的溶解度和親水性. 如果肽段太短，合成可能會出現問題。主要問題是合成的肽在后處理過程中存在一定的難度。5肽以下的肽一般需要疏水性氨基酸，否則后處理比較困難。
8、如何從肽序列中確定肽的溶解度？
如果肽中含有高比例的疏水性氨基酸，如 Leu、Val、IIe、Met、Phe 和 Trp，則很難溶解在水溶液中或根本無法溶解。這些氨基酸，無論是純化的還是合成的，可能有問題。
一般疏水氨基酸比例<50%，連續5個氨基酸不能疏水，帶電荷氨基酸比例（正電荷K、R、H、N端，負電荷D、E、C端) 達到 20%，在肽 N 或 C 中，如果可以增加極性氨基酸，也可以提高溶解度。
9、為什么合成含有 Cys、Met 或 Trp 的肽很困難？
合成含有Cys、Met或Trp的肽并獲得高純度產品是困難的。主要原因是這些基團不穩定，容易氧化。應特別注意這些肽的使用和儲存，避免重復打開蓋子。
10、為什么某些肽的合成收率或純度較低？
肽合成和引物合成有比較大的區別。不能合成的引物很少，但往往有不能合成的肽。由于Val、Lle、Tyr、Phe、Trp、Leu、Gln、Thr是直系同源或重復的氨基酸，在合成過程中肽鏈不能完全溶解，合成效率降低。在以下情況下，產品的合成效率和純度都比較低，如：重復pro、Ser-Ser、重復ASP、四連續Gly等。
11、如何純化肽？
通過反相柱（如C8、C18等）在214 nm處純化肽。緩沖系統通常是含有 TFA（pH 值為 2.0）的溶劑。緩沖液 A 在 ddH 2中含有 0.1% TFAO, 緩沖液 B 含有 1% TFA / ACN / ph2.0。Buffer A 用于在純化前溶解肽；如果溶液不好，用Buffer B溶解，再用Buffer A稀釋。對于強疏水性肽，有時需要添加少量甲酸或乙酸。多肽粗品的HPLC分析，如果多肽不長（15aa以下），一般會有一個主峰，主峰通常是全長產物；對于20aa以上的長肽，如果沒有主峰，HPLC需要匹配質量確定分子量，然后確定哪個峰是要合成的肽。
12、適合免疫的肽多長時間？
一般約為10-15個氨基酸。當然氨基酸數量越多，免疫效果越好，但合成費用也會增加。然后預計映射肽的長度將超過 15 個氨基酸。此外，10個氨基酸以下的肽在免疫方面的效果較差。
13、肽的外觀是什么？
肽是粉末狀的，通常是白色的。肽粉的顏色隨著成分的不同而不同，比如一些帶有FITC修飾的黃綠色。
14、如何溶解多肽？
溶解多肽非常復雜，通常很難一次確定合適的溶劑。一般是先取一點進行試驗，不要完全溶解后再確定合適的溶劑。
以下方法可幫助您選擇合適的溶劑：
確定肽的比電荷，將酸性氨基酸ASP（D）、Glu（E）和C端COOH設置為-1；堿性氨基酸Lys(K)、Arg(R)、His(H)和N端NH2為+1，其他氨基酸的電荷為0。計算電荷數。
如果凈電荷數 > 0，則肽呈堿性，用水溶解：如果不溶或不太溶，加入乙酸（10% 以上）；如果肽尚不溶解，則加入少量 TFA（25 ul）溶解，然后加入 500 ul 水稀釋。
若凈電荷數<0，肽呈酸性，溶于水；如果不溶解或不太溶解，加入氨水（25 ul）溶解，然后加入 500 ul 水稀釋。
如果凈電荷數=0，肽是中性的，一般需要用乙腈、甲醇或異丙醇、DMSO等有機溶劑溶解。也有人提出需要尿素來溶解疏水性強的肽.
15、如何儲存合成肽？
多肽長期保存一般需要避光保存，短期保存應在–20℃和4℃保存。肽可以在室溫下短時間運輸。肽在-20℃下是穩定的，尤其是冷凍干燥并儲存在干燥器中。冷凍干燥的肽在暴露于空氣之前可以在室溫下儲存。這將減少濕度的影響。當無法進行凍干時，最好的方法是少量儲存樣品。
對于含有 Cys、Met 或 Trp 的肽，脫氧緩沖液對于它們的溶解是必不可少的，因為這些肽很容易被空氣氧化。在封端之前緩慢流過肽的氮氣或氬氣也可以減少氧化。含有 Gln 或 Asn 的肽也很容易降解，與沒有這些問題和簡單肽的肽相比，所有這些肽的壽命有限。
16、如何處理肽的兩端？它是免費的還是受保護的？
肽用于模擬蛋白質。為了模擬蛋白質的表達，我們需要合成與蛋白質具有相似結構和電荷的肽。當一個肽從蛋白質中“切出”時，兩端的電荷數將與基因體蛋白的電荷數不同。我們需要改變合成策略以使它們保持一致。一般來說，如果來自蛋白質的C端，N端被乙?；帘?；如果它來自蛋白質的N端，則C端被酰胺化屏蔽；如果它來自蛋白質的中間部分，則兩端被乙?；王０坊帘?。
17、什么是電噴霧電離質譜（electrospray ionization，EIS）？
EIS可以產生多價離子化的蛋白質或多肽，可以分析相對分子量為1×10 5的蛋白質，分辨率為1500-2000 amu。準確率約為 0.01%。EIS 更適用于高分子量蛋白質的在線分析，需要氣化或有機溶劑對樣品進行敏化。
18、什么是基質輔助激光解離/電離飛行時間質譜 (MALDI-TOF MS)？
MALDI-TOF是目前蛋白質鑒定中準確測定分子質量的一種手段，特別適用于測定混合蛋白肽種類的相對分子質量，具有良好的靈敏度和分辨率。它是當前蛋白質組學研究的必備工具。一種與液相色譜同時結合的聯用技術可以高效地鑒定肽種類。尤其是當質譜技術的各種原理串聯應用時，不僅可以獲得肽的相對分子質量信息，還可以確定其序列結構，該技術將在未來的蛋白質組學研究中具有決定性意義。
19、什么是高效液相色譜（HPLC）？什么是反相高效液相色譜 (RP-HPLC)？
高效液相色譜的出現為多肽的分離提供了一種有利的方法。與其他化合物相比，在合適的色譜條件下，蛋白質和多肽的分離可以在短時間內完成。更重要的是，高效液相色譜法可以大規模生產生物活性肽。因此，許多學者為尋找多肽分離制備的最佳條件做了大量工作。如何保持多肽活性、如何選擇固定相材料、洗脫液種類、如何分析確定是目前的研究內容。
反相高效液相色譜（RP-HPLC）：結果與保留值的關系：用RP-HPLC分離肽，需要確定不同結構的肽在柱上的保留。為了獲得一系列保留系數，Wilce 等人。采用多元線性回歸法分析了2106種多肽的保留性質和結構，得到了不同氨基酸組成與保留系數之間的關系?？蓽p少2-20個氨基酸肽中極性氨基酸殘基的保留時間；在10-60個氨基酸肽段中，更多的非極性氨基酸也可以減少在柱上的保留時間，而在5-25個氨基酸肽段中，更多的非極性氨基酸可以延長在柱上的保留時間。
20、為什么在 RP-HPLC 中使用梯度洗脫？
目前，RP-HPLC是研究多肽相關物質合成最常用的方法。但由于合成多肽中相關物質的性質不同，單純的等度洗脫法難以全面檢測產品中的各類有機雜質。
21、質譜中如何確定單同位素峰和平均同位素峰？
在低分辨率的質譜中，顯示的峰通常是平均同位素峰。然而，質譜（如MALDI-TOF）的分辨率非常高。一般的小分子（如肽段）常含有4-5個同位素峰，其中分子量最小的是單同位素峰。使用質譜法檢測大分子（如完整蛋白質）時，同位素峰的數量非常多，在圖譜上難以區分。在這種情況下，使用平均同位素峰更有意義。
22、同位素峰之間是否有 1 Da 的差異？
同位素肽的質量（m）一般相差1 Da，但質譜檢測到的峰是肽的質荷比（m/z）而不是質量本身，當肽的質荷比差異小于1時有多項收費。如果檢測到的肽帶一個電荷，則同位素峰之間的差值為 1；如果檢測到的肽段有兩個電荷，則同位素峰之間的差值為 0.5；如果檢測到的肽段帶三個電荷，則同位素峰之間的差值為 0.33；等等。因此，從同位素峰之間的距離，我們可以推斷肽的帶電狀態（z），從而推斷肽的單個同位素質量[（m/z）*z]。
23、單同位素峰一定是最高的嗎？
單同位素峰必須在一組峰中具有最低的質荷比，但不一定是最高的。當肽的分子量較小時，肽中的原子總數也較少，整個肽含有同位素原子的概率較小。此時，單同位素峰往往是最高峰。當肽的分子量增加時，攜帶同位素原子的概率增加。在這種情況下，+1 Da 甚至+2 Da 的同位素峰可能是最高的。統計結果表明，當多肽的分子量大于2500 Da時，該峰不是單同位素峰。
24、除了 HPLC 和 MS，還有哪些其他肽分析方法可用？
還可提供水餾分、離子色譜、元素分析、氨基酸組成分析、圓二色譜、NMR、IR、UV、內毒素、微生物等分析。
25、肽通常攜帶的抗衡離子是什么？
多肽凍干粉一般配三氟乙酸鹽，如果是做細胞實驗或動物實驗，建議換成乙酸鹽或鹽酸鹽。
26、可以提供哪些同位素標記的肽？
可以提供一些穩定的同位素修飾肽，主要包括N15、C13??和氘修飾。由于穩定同位素氨基酸原料價格昂貴，建議選擇一些簡單的氨基酸進行標記，如Gly、Val、Phe、Leu、Ala等。
27、影響多肽穩定性的因素有哪些？
影響合成肽穩定性的因素包括脫酰胺、氧化、水解、二硫鍵錯配、消旋化、β-消除、聚集等。合成肽最常見的降解產物是脫酰胺產物、氧化產物和水解產物。在各種氨基酸中，天冬酰胺和谷氨酰胺容易脫酰胺（特別是在高pH和高溫下）；蛋氨酸、半胱氨酸、組氨酸、色氨酸和酪氨酸最容易被氧化，對光敏感；天冬氨酸形成的肽鏈容易斷裂，尤其是ASP-Pro和ASP-Gly肽鍵。肽的聚集主要是由疏水相互作用引起的。雖然目前很難準確預測哪些肽段容易聚集，至少對于一些中長肽段來說，
28、Fmoc/tBu固相合成（SPPs）如何選擇樹脂？
C端羧肽合成可選用Wang樹脂；對于C端酰胺肽的合成，可選擇Rink Amide AM Resin或Rink Amide MBHA Resin；對于全保護肽的合成，我們可以選擇2-Cl Trt Resin。
29、樹脂的參數是什么？參數的含義是什么？
一般樹脂的參數包括載量、目數和規格，如1% DVB。
載量：單位為mmol/g，即每克樹脂存在多少毫摩爾官能團。
目數：粒度一般為100-200目，數值越大，顆粒越細。
1% DVB：交聯劑二乙烯基苯在苯乙烯和二乙烯基苯共聚物中的比例。
30、Fmoc保護氨基酸樹脂的負載量計算方法有哪些？
Fmoc保護氨基酸樹脂載量的計算一般有兩種方法，一種是增重法，增加的重量除以分子量，再除以樹脂的總重量。另一種是通過紫外分析。目前我司提供UV分析加載值。
31、什么樣的肽可以通過紫外分析來計算肽含量？
如果肽段序列中含有Trp或Tyr，可用紫外法分析肽段的含量，根據摩爾消光系數：
色氨酸 5,560 AU/mmole/ml
酪氨酸 1,200 AU/mmole/ml
（280 nm at 中性pH使用 1 cm 比色皿）
肽的摩爾消光系數可以根據每個色氨酸或酪氨酸的系數相加，然后根據在 280 nm 處測得的吸光值按公式計算。
mg 肽/ml = (A280 x DF x MW) / e
A280，280 nm 處的實際吸收值（1 cm 池），
DF，稀釋因子，
MW，肽的分子量
e，肽的摩爾消光系數
32、肽與其他化合物或載體的結合應考慮哪些因素？
一些肽往往需要與一些具有特定功能的藥物或化合物，或一些載體連接。這些過程需要化學鍵結合。通常，當肽具有氨基或羧酸官能團時，可以考慮相應的羧酸或氨基進行縮合。另一種選擇是在 pH 8 的環境中將馬來酰亞胺與硫醇連接。肽可以用 Cys 或馬來酰亞胺官能團進行修飾。馬來酰亞胺改性通?？梢酝ㄟ^ 3-馬來酰亞胺丙酸 (CAS 7423-55-4) 實現。
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